Vaccini a mRNA antitumorali

Se non lo sai spiegare in modo semplice,
non l’hai capito abbastanza bene.
 Albert Einstein, fisico

I vaccini sono composti che stimolano il sistema immunitario a rispondere a un patogeno invasore – per es. un batterio o un virus – o a un tumore. Essi, pertanto, aiutano l’organismo a riconoscere e distruggere microrganismi o cellule neoplastiche. Nel corso del tempo sono stati sviluppati diversi tipi di vaccini antitumorali, usualmente a scopo terapeutico e privi di una significativa efficacia. Si deve alla recente pandemia di COVID-19 se l’attenzione è stata rivolta ai vaccini a mRNA, generalmente percepiti come una novità che ha suscitato molte aspettative anche in Oncologia. In realtà, questi vaccini trovano la loro origine proprio nei tentativi di migliorare la terapia dei tumori, anche se il loro uso profilattico anti-COVID-19 ha contribuito a sviluppare una tecnologia che può essere proficuamente utilizzata in vari settori della Medicina.

La storia è iniziata negli anni 1960. Dopo la scoperta della struttura del DNA nel 1953, era noto che questa molecola conteneva l’informazione genetica per la sintesi delle proteine e che gli aminoacidi erano assemblati in proteine negli organuli citoplasmatici chiamati ribosomi. Poiché le proteine non erano sintetizzate direttamente dai geni, era necessario ammettere l’esistenza di un elemento intermedio che trasportasse l’informazione. Si era ritenuto che fosse l’RNA ribosomiale (rRNA) – una struttura stabile che insieme alle proteine costituisce i ribosomi – ma varie osservazioni suffragavano invece l’ipotesi di François Jacob e Jacques Monod che faceva riferimento a un intermediario instabile o ‘messaggero’ che trasportava l’informazione genetica dal nucleo ai ribosomi del citoplasma. Questo RNA messaggero (mRNA) fu scoperto nel 1961 da Sidney Brenner, che individuò anche l’esatta funzione del ribosoma. Nessuno però a quel tempo pensava all’mRNA come farmaco, per la sua instabilità e per l’assenza di mezzi atti a produrre materiale genetico in laboratorio per ridurre il costo elevato dell’estrazione dell’acido nucleico da fonti animali.

Verso la metà degli anni 1960 furono scoperti i liposomi, ma dovettero passare molti anni prima che queste due scoperte – dell’mRNA e dei liposomi – convergessero in un unico filone di ricerca.

Nel 1978 alcuni ricercatori avevano usato con successo i liposomi per trasportare l’mRNA all’interno di cellule per indurre l’espressione di proteine. Era questo un metodo per proteggere l’mRNA dagli enzimi che lo idrolizzano (ribonucleasi), poiché i liposomi si fondono con la membrana cellulare e lo liberano intatto nella cellula, dove può svolgere la sua funzione. Alcuni anni dopo (1984) altri ricercatori riuscirono a produrre mRNA sintetico biologicamente attivo in laboratorio, rendendolo facilmente disponibile.

A creare le premesse per una svolta decisiva nell’uso dell’mRNA in Medicina fu però un esperimento condotto verso la fine del 1987 da Robert Malone al Salk Institute for Biological Studies di La Jolla, California. Egli preparò una mistura di filamenti di mRNA e goccioline di grasso, vi immerse cellule umane e osservò che assorbivano l’acido nucleico e lo usavano come stampo per produrre proteine. Capì subito che era possibile “trattare l’RNA come farmaco” e, usando mRNA sintetico, introdusse l’impiego di liposomi con carica elettrica positiva (liposomi cationici), che avevano una maggiore capacità di interagire con lo scheletro dell’mRNA carico negativamente. Cercò anche di esplorare l’uso dell’mRNA per la produzione di vaccini, ma finì per dedicarsi allo sviluppo di vaccini a DNA.

Per anni la ricerca sui vaccini a mRNA fu abbandonata, poiché si riteneva che l’acido nucleico era troppo incline alla degradazione e la sua produzione troppo costosa.

Inizialmente, l’idea di svilupparli trovò un terreno più fertile in Oncologia, sebbene con l’intento di curare e non prevenire la malattia. Se l’mRNA codificava proteine espresse dalle cellule neoplastiche, si pensava che, iniettandolo nel corpo, avrebbe indirizzato il sistema immunitario ad attaccarle. I primi esperimenti nell’animale e nell’uomo non furono coronati da risultati brillanti, ma all’inizio degli anni 2000 uno studio con mRNA stabilizzati con protamina codificanti diversi antigeni del melanoma, dimostrò che il vaccino stimolava un’efficace risposta immunitaria con effetti collaterali di moderata entità.

Tra i numerosi ricercatori interessati all’argomento, gli immunologi di origine turca Ugur Sahin e la moglie Özlem Türeci nel 2008 avevano fondato l’azienda BioNTech – con sede a Magonza in Germania – con l’obiettivo principale di scoprire farmaci a base di mRNA per l’immunoterapia del cancro e vaccini contro le malattie infettive. Già nel 2010 avevano riportato i risultati del primo studio preclinico con vaccino a mRNA nudo (somministrato direttamente nei linfonodi), dimostrando che era in grado di stimolare una potente immunità antitumorale, ma nel gennaio 2020 – in seguito alla comparsa della COVID-19 – i loro sforzi sono stati rivolti soprattutto a produrre un vaccino a mRNA per la prevenzione della pandemia.

Un contributo notevole a rendere più efficiente l’introduzione di mRNA nelle cellule fu apportato dalla biochimica di origine ungherese Katalin Karikó, che nel 1997 aveva iniziato con l’immunologo Drew Weissman, University of Pennsylvania, a sviluppare un vaccino a mRNA contro l’HIV. Fu preparato un mRNA che codificava la proteina gag del virus e, una volta trasferito in cellule dendritiche in coltura, si poté osservare che produceva la proteina e stimolava la risposta immunitaria. Le cellule dendritiche, però, producevano anche una grande quantità di citochine infiammatorie. Era questo un effetto inaspettato, incomprensibile – poiché per produrre l’mRNA venivano usati gli stessi elementi che normalmente si trovano nelle cellule del corpo, cioè le stesse basi azotate – e molto pericoloso. Era infatti noto che le cellule T coinvolte nella risposta immunitaria potevano in certi casi rilasciare una grande quantità di citochine che, riversandosi nel sangue, causavano febbre elevata, sintomi simil-influenzali e grave ipotensione, espressione della sindrome da rilascio di citochine, potenzialmente mortale. Era chiaro che per rendere l’mRNA terapeuticamente utile, bisognava capire perché ciò succedeva e come porvi rimedio. Occorsero anni di accurati e pazienti esperimenti per comprendere finalmente che, a causare la risposta infiammatoria, era l’assenza di modifiche nell’RNA. In natura sono molto diffuse piccole modifiche strutturali a carico delle basi azotate (adenina, citosina, guanina e uracile) – per es. variazioni della posizione di gruppi ossidrilici o metilici – che consentono alla molecola di funzionare normalmente. L’mRNA dei mammiferi contiene molte modifiche e non è infiammatorio, al contrario dell’RNA batterico e dell’mRNA sintetico che non presentano modifiche dei nucleosidi, ma sono altamente infiammatori. Era quindi evidente che l’organismo nel corso di millenni di evoluzione aveva imparato a difendersi dall’intrusione di molecole estranee, sviluppando un sistema immunitario capace di distinguere tra le molecole di RNA con modifiche strutturali e quelle senza tali modifiche. Si poté anche appurare che ciò avviene attraverso il sistema immunitario innato, le cui cellule costitutive contengono recettori – chiamati toll-like (TLR) – che non rilevano antigeni specifici, ma identificano configurazioni molecolari potenzialmente pericolose.

Così, l’mRNA naturale – che presenta modifiche a carico del nucleoside uridina – non è immunogenico, mentre l’mRNA sintetico non modificato attiva diversi TRL ed è immunogenico. Per ottenere un vaccino a mRNA terapeuticamente utile, era quindi necessario evitare la reazione infiammatoria, modificando l’uridina. Nel 2005 Karikò e Weissman dimostrarono che la sostituzione dell’uridina con la pseudouridina sopprimeva la capacità dell’RNA di stimolare il sistema immunitario, poiché non veniva più riconosciuto come nemico da eliminare. Non solo, l’mRNA così modificato veniva anche tradotto in un maggior numero di proteine.

Nonostante si trattasse di una scoperta rivoluzionaria, poiché era in grado di dare l’avvio a un’epoca del tutto nuova per la produzione di farmaci e vaccini, pochi ne riconobbero l’importanza. Lo studio non fu accettato da riviste prestigiose, quali Nature, e poté essere pubblicato su Immunity solo dopo aver effettuato una serie di esperimenti supplementari, probabilmente non necessari.

Il riconoscimento dell’importanza avvenne nel 2010 quando Derrick Rossi – biologo delle cellule staminali del Boston Children’s Hospital, Massachusetts – dimostrò che cellule differenziate potevano essere trasformate in cellule pluripotenti con la somministrazione di mRNA sintetico modificato. La formazione di cellule staminali pluripotenti – derivate da cellule adulte invece che da cellule embrionali – era, infatti, un obiettivo intensamente perseguito per la possibilità di generare tipi cellulari clinicamente utili, per es. nella riparazione di deficit post-traumatici, nel diabete e nel morbo di Parkinson. Sulle ali del successo, Rossi co-fondò nello stesso anno l’azienda biotecnologica ModeRNA Therapeutics, dedicata all’impiego di mRNA modificato (come indicato dal suo nome che comprende queste due parole).

Lo sviluppo dell’mRNA modificato con pseudouridina non va però disgiunto dall’evoluzione tecnologica nella formulazione di nanoparticelle lipidiche per proteggerlo e facilitarne il trasporto all’interno delle cellule (Fig. 1). È sulla base di questa metodologia che Moderna e BioNTech-Pfizer hanno sviluppato i loro vaccini anti-COVID-19, risultati molto efficaci nel prevenire la pandemia. A Weissman e Karikò nel 2023 è stato assegnato il Premio Nobel per la Medicina o Fisiologia per le loro scoperte sulle modifiche delle basi nucleosidiche, che hanno consentito lo sviluppo di vaccini a mRNA efficaci contro la COVID-19.

 

Fig. 1. Vaccino a mRNA. I vaccini anti-COVID prodotti da Moderna e Pfizer-BioNTech usano mRNA modificato, in cui l’uridina è sostituita con la pseudouridina (ψ, psi). Questa modificazione aumenta la stabilità e la capacità traslazionale dell’mRNA, oltre a eliminarne l’immunogenicità. La sequenza del mRNA codifica la proteina spike di SARS-CoV-2, usata dal virus per penetrare nelle cellule. I vaccini usano nanoparticelle lipidiche per trasportare le molecole di mRNA all’interno delle cellule. Ogni nanoparticella attorno al mRNA è costituita da varie molecole lipidiche, tra cui lipidi ionizzabili. Questi hanno una carica positiva – che conferisce vantaggi simili a quelli dei liposomi cationici – e si legano all’mRNA che è carico negativamente. In condizioni, come quelle presenti nel sangue, perdono però la carica positiva, riducendo in tal modo la loro tossicità.

 

Così, dalla fine degli anni 1980 (quando è nato il concetto di farmaci a mRNA) centinaia di ricercatori – dedicatisi con impegno e passione a superare i numerosi problemi correlati all’instabilità della molecola, al costo e alla sua immunogenicità – sono riusciti a creare i presupposti per formulare nel 2020 un vaccino a mRNA di successo anti-COVID-19, che ha aperto la strada a una serie di studi in una vasta gamma di malattie, grazie alla grande versatilità della molecola. Diverse malattie sono causate dall’assenza o dal funzionamento difettoso di una proteina e l’mRNA può teoricamente codificare ogni tipo di proteina: può cioè indurre le cellule a produrre le medicine di cui l’organismo ha bisogno. C’è anche da considerare che, in confronto ai vaccini a base di DNA, numerosi studi hanno dimostrato che quelli a mRNA producono le proteine bersaglio più efficientemente poiché la loro espressione avviene nel citoplasma, senza necessità di entrare nel nucleo; eliminano la possibilità di integrazione nel genoma della cellula con conseguente modificazione del codice genetico; e permangono nell’organismo solo per un tempo breve, essendo rapidamente metabolizzati dai normali processi fisiologici.

Una parte di questi successi è stata resa possibile dagli studi effettuati sulle malattie neoplastiche prima della COVID-19, compreso lo sviluppo del sequenziamento di nuova generazione (NGS): una serie di tecnologie che consentono di sequenziare in parallelo una grande quantità di acidi nucleici. Usata inizialmente per evidenziare le mutazioni presenti nei tumori, la metodica si è rivelata essenziale per sequenziare migliaia di genomi del virus della COVID-19 in tutto il mondo, consentendo una migliore conoscenza della diffusione e dell’evoluzione del virus, compresa la caratterizzazione delle numerose varianti di volta in volta emerse.

È però anche vero che la tecnologia usata per sviluppare i vaccini anti-COVID-19 può essere riproposta per creare vaccini terapeutici a mRNA contro il cancro in tempi relativamente brevi. Concettualmente, basterebbe attivare il sistema immunitario a cercare e distruggere le cellule tumorali anziché il coronavirus. A tal fine, invece di trasportare il codice per identificare il virus, il vaccino dovrà contenere le istruzioni genetiche per gli antigeni tumorali che si trovano sulla superficie delle cellule neoplastiche.

I primi vaccini terapeutici antitumorali erano diretti contro gli antigeni tumore-associati (TAA), le cui eterogeneità e scarsa immunogenicità – sono antigeni non mutati, presenti anche nei tessuti normali – non hanno consentito di ottenere risultati apprezzabili. Più recentemente, l’attenzione dei ricercatori è stata rivolta agli antigeni tumore-specifici (TSA), generati dalle progressive mutazioni intercorrenti nelle cellule neoplastiche con formazione di neoantigeni. Essendo espressi esclusivamente dalle cellule tumorali, i neoantigeni possono indurre una risposta immunitaria specifica, evitando pertanto di coinvolgere le cellule normali con conseguente possibilità di prevenire effetti collaterali indesiderati.

Il primo passo nella produzione di un vaccino antitumorale a mRNA consiste nel disegnare uno stampo di DNA per la trascrizione in vitro di un filamento di mRNA che codifica la/e proteina/e desiderata/e. Durante il processo di trascrizione si provvede quindi all’inserimento di nucleotidi modificati – in genere pseudouridina – per ridurre l’immunogenicità e aumentare l’efficienza della traduzione. La terza tappa fondamentale riguarda il metodo di somministrazione. Tra le varie strategie disponibili, i liposomi cationici sono ritenuti uno dei sistemi più avanzati.

Vaccini a mRNA sono attualmente in fase di sviluppo in numerosi tipi di cancro.

Nel caso di vaccini a mRNA codificanti TAA, trattandosi di antigeni non mutati e con scarsa immunogenicità, può insorgere tolleranza immunitaria che ne riduce l’attività. Il primo vaccino a mRNA è stato sviluppato nel topo nel 1995 e codificava l’antigene carcinoembrionario (CEA). L’uso di questi vaccini è attualmente quello più pratico, poiché sono espressi preferenzialmente nelle cellule cancerose e possono essere usati in tutti i pazienti affetti da una determinata neoplasia. Ne sono esempi alcuni vaccini della BioNTech: BNT111 (melanoma), BNT112 (carcinoma prostatico), BNT 113 (carcinoma mammario), BNT116 (carcinoma polmonare non a piccole cellule).

I vaccini a mRNA codificanti TSA sono quelli maggiormente oggetto di studio e, grazie alla tecnologia NGS, sono personalizzati poiché sono generati da cellule prelevate dal tumore del malato. Una singola molecola di mRNA può codificare anche qualche decina di neoantigeni, in rapporto al numero delle mutazioni presenti nel tumore del paziente. Dopo la somministrazione, il vaccino è captato dalle cellule presentanti l’antigene (APC) e l’mRNA tradotto in proteine che, nel proteasoma, sono degradate in peptidi antigenici. Essi sono quindi presentati sulla superficie delle APC e inducono la risposta di linfociti T citotossici, che specificamente riconoscono e distruggono le cellule cancerose del paziente che esprimono quei neoantigeni (Fig. 2). Sono coinvolti anche i linfociti T helper che potenziano l’effetto delle cellule B che producono anticorpi. Esempi sono: BNT 122 (adenocarcinoma pancreatico) della BioNTech e mRNA-4157 (melanoma) di Moderna e Merck.

 

Fig. 2. Risposta immunitaria ai vaccini a mRNA. Dopo la somministrazione, il vaccino è captato dalle cellule presentanti l’antigene (APC), dove è rilasciato l’mRNA che viene tradotto nelle proteine codificate. Queste sono degradate nel proteasoma in peptidi antigenici che sono presentati alle molecole MHC di classe I espresse sulle cellule T CD8+ (linfociti citotossici che attaccano le cellule cancerose mediante granzimi e perforine). Gli antigeni sono anche presentati – attraverso le molecole MHC di classe II – alle cellule T CD4+ (linfociti helper), che possono aumentare l’effetto antitumorale delle cellule B, produttrici di anticorpi.

 

I vaccini a mRNA codificanti immunostimolanti sono indicativi di una nuova direzione della ricerca nel settore. L’importanza degli immunostimolanti (citochine) sta nel fatto che possono rimodellare il microambiente immunitario del tumore e superare la tolleranza immunitaria al tumore stesso. Esempi sono: mRNA-2416 (neoplasie varie) di Moderna e BNT151-153 (neoplasie varie) di BioNTech.

Diversi studi clinici condotti da BioNTech e Moderna hanno già dimostrato che i vaccini a mRNA possono indurre una potente immunità antitumorale in varie neoplasie solide. Spesso però, per aumentarne l’efficacia, sono associati a inibitori dei checkpoint, anticorpi monoclonali, modulatori del microambiente tumorale e chemioterapia o radioterapia.

Ci sono pertanto le premesse per sviluppare vaccini a mRNA contro molteplici tumori solidi, ma il cammino della ricerca si prospetta ancora abbastanza lungo.