Tesi di Laurea: “Analisi dei meccanismi molecolari di modulazione del dolore indotti da Upadacitinib su pazienti affetti da artrite reumatoide e su coltura di cellule microgliali” (Sintesi)

Background

L’artrite reumatoide è una malattia cronica, autoimmune a eziologia sconosciuta. È la forma più comune di artrite cronica ed è caratterizzata da una poliartrite simmetrica che, in assenza di trattamento, progredisce fino alla distruzione delle cartilagini articolari e dell’osso¹. I dati disponibili provengono maggiormente dal Nord Europa e dall’America; pertanto, le stime epidemiologiche e sull’identificazione dei fattori di rischio si basano su queste popolazioni. La prevalenza globale della patologia è stimata essere intorno allo 0,24 percento².  L’incidenza annuale è circa di 40 su 100.000 persone³. L’artrite reumatoide esordisce in modo insidioso con dolore, rigidità mattutina e gonfiore articolare, interessando inizialmente le piccole articolazioni di mani e polsi in modo simmetrico. Con il progredire della malattia, possono essere coinvolti gomiti, spalle, ginocchia, anche e piedi, con deformità articolari croniche e limitazione funzionale^4, 5. Le manifestazioni extrarticolari includono stanchezza cronica, noduli reumatoidi, coinvolgimento polmonare (interstiziopatia, versamenti pleurici), cardiaco (pericardite, aumento del rischio cardiovascolare), osteoporosi, sintomi oculari (cheratocongiuntivite secca, sclerite) e anemia⁶. Il coinvolgimento del rachide cervicale può portare a complicanze neurologiche gravi⁷.

Il trattamento dell'artrite reumatoide si basa sull'approccio "treat to target", con l'obiettivo di raggiungere la remissione o una bassa attività di malattia per prevenire danni articolari⁸. La terapia si avvale principalmente dei Disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs), che si dividono in tre categorie. I conventional synthetic DMARDs (csDMARDs), come il metotrexato, sono i trattamenti di prima linea, ma in caso di controindicazioni o effetti collaterali, vengono utilizzati altri farmaci come leflunomide o sulfasalazina. I biological DMARDs (bDMARDs), invece, comprendono terapie anticitochiniche come gli inibitori del TNF-α (infliximab, etanercept, adalimumab) e gli inibitori dell'interleuchina 6 (tocilizumab, sarilumab). Infine, i targeted synthetic DMARDs (tsDMARDs), come tofacitinib, upadacitinib, filgotinib e peficitinib, inibiscono specifiche vie di segnalazione infiammatorie attraverso il blocco della Janus Chinasi (JAK), rappresentando una classe terapeutica innovativa per i pazienti non responsivi ad altri trattamenti⁹.

I pazienti con artrite reumatoide indentificano il dolore come il problema più importante e come il sintomo più invalidante, spesso associato a distress psicologico capace di impattare diverse funzioni fisiche e sociali¹⁰. Tradizionalmente l’infiammazione periferica articolare è sempre stata considerata il motore principale delle sensazioni dolorifiche. In effetti, durante la sinovite acuta, l’intensità del dolore è direttamente correlata alla gravità dell’infiammazione¹¹. Nonostante questo, nella pratica clinica, spesso il dolore permane anche in assenza di tumefazioni articolari e dopo l’abbassamento degli indici infiammatori. Di conseguenza, è necessario porre l’attenzione sulla quota di dolore non infiammatorio, definito dolore nociplastico¹². Il dolore nociplastico è definito come dolore caratterizzato da un processo di nocicezione alterato a livello del sistema nervoso centrale. L’amplificazione anomala del segnale nervoso nocicettivo provoca la tipica ipersensibilità al dolore anche in assenza di un danno tissutale o in assenza di segnali di pericolo provenienti dalla zona interessata¹³. In letteratura sono usati diversi sinonimi di questo termine come sensibilizzazione centrale o dolore cronico centralizzato. I sintomi tipici del dolore nociplastico sono l’iperalgesia, un’aumentata risposta ad uno stimolo doloroso, e l’allodinia, la sensazione dolorosa seguita a uno stimolo non doloroso¹³. La patofisiologia non è caratterizzata dai meccanismi molecolari del dolore tradizionali e storicamente questi disturbi sono sempre stati definiti come psicosomatici, conferendo a questo tipo di dolore, non una funzione adattativa e potenzialmente protettiva, come nel dolore infiammatorio o neuropatico, ma disfunzionale¹⁴. La patofisiologia del dolore nociplastico può essere spiegata mediante meccanismi top-down e bottom-up. I meccanismi top-down riguardano l’amplificazione del dolore attraverso l’alterazione di alcune vie modulatorie discendenti, come il grigio periacqueduttale e il midollo rostrale ventromediale. Queste vie proiettano sul midollo spinale e, attraverso il rilascio di alcune sostanze analgesiche endogene, possono diminuire la sensibilità nocicettiva periferica. La disregolazione di questi meccanismi risulta in un’amplificazione dolorifica e dunque nello sviluppo della componente nociplastica. I meccanismi bottom-up riguardano le vie dolorifiche ascendenti all’interno del sistema nervoso centrale, che sono stimolate dalla periferia. Lo stimolo in questo caso è, almeno inizialmente, generato da una alterazione nocicettiva vera e propria a livello periferico, ma la continuazione incontrollata dello stimolo doloroso potrebbe portare ad una crescita e riorganizzazione delle sinapsi neuronali all’interno del sistema nervoso centrale¹³. Questo fenomeno è noto come plasticità sinaptica e potrebbe essere alla base dello sviluppo della fibromialgia secondaria nei pazienti con malattie reumatologiche^15, 16 (Fig. 1).

 

Fig. 1. Panoramica dei meccanismi nocicettivi centrali e periferici nell'artrite reumatoide (Cao et al., 2020).

 

Il termine microglia fu per la prima volta introdotto nel 1919 dal neuroscienziato spagnolo Pio del Rìo Hortega, il quale distinse le cellule non neuronali del sistema nervoso centrale, in astrociti, microglia e oligodendrociti. Le cellule della microglia rappresentano la componente di fagociti mononucleati residenti all’interno del sistema nervoso centrale¹⁷. Negli ultimi dieci anni le pubblicazioni riguardanti il ruolo della microglia nella genesi del dolore cronico sono drasticamente aumentate. Se la maggior parte delle ricerche passate si sono concentrate sulle funzioni microgliali riguardanti la potatura sinaptica e il mantenimento omeostatico all’interno del sistema nervoso centrale, i ricercatori nel campo del dolore hanno recentemente cercato di identificare i neuromodulatori e i principali meccanismi molecolari attraverso cui le cellule microgliali possono modulare e influenzare la plasticità sinaptica, un meccanismo patogenetico fondamentale nella genesi del dolore cronico¹⁸. L’attivazione della microglia e la neuroinfiammazione giocano un ruolo chiave nel dolore nociplastico. Le citochine pro-infiammatorie (IL-1β, TNF-α, IL-6) potenziano la trasmissione sinaptica eccitatoria nel midollo spinale, modulando recettori coinvolti nella percezione del dolore (AMPA-R, NMDA-R, Gly-R, GABA-R)¹⁹. Inoltre, la microglia rilascia molecole neuromodulatorie come il Peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP), la sostanza P (SP) e il Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)²⁰.  Il BDNF è coinvolto nella regolazione del dolore sia a livello periferico che centrale. In condizioni infiammatorie, l’aumento dei suoi livelli favorisce la sensibilizzazione centrale^21, 22. Nelle radici dorsali spinali, viene rilasciato insieme a neuropeptidi come SP e CGRP, contribuendo all’iperalgesia e allodinia attraverso l’attivazione dei recettori TrkB e delle chinasi P13K/ERK²³. Nel midollo spinale, la microglia secerne BDNF in risposta all’attività neuronale e agli stimoli infiammatori. Il pathway ATP-P2X4-BDNF riduce l’inibizione neuronale e amplifica l’eccitazione, favorendo la sensibilizzazione centrale²⁴ (Fig. 2).

	Fig. 2. Ruolo della microglia e del rilascio del BDNF nella genesi del dolore nociplastico (Atta et al., 2023).

I dati più recenti provenienti dai trial clinici sui JAK inibitori nel trattamento dell’artrite reumatoide mostrano un controllo ottimale del dolore, persino superiore a quello ottenuto con i farmaci biologici inibitori del TNF-alfa. Tuttavia, non sono state riscontrate differenze significative nei principali indici clinimetrici e nei marcatori infiammatori, come la velocità di eritrosedimentazione delle emazie (VES), la proteina C reattiva (PCR) e la conta delle articolazioni tumefatte^25, 26.  Questo suggerisce che l’inibizione di JAK1 e JAK2 potrebbe contribuire alla riduzione del dolore sia infiammatorio che non infiammatorio nell’artrite reumatoide²⁷. Dal punto di vista fisiopatologico, la riduzione del dolore residuo potrebbe dipendere dal ruolo del pathway JAK/STAT nella regolazione di numerose citochine pro- e antinfiammatorie, a differenza dei bDMARDs, che agiscono bloccando singole citochine o i loro recettori²⁸. Nonostante questi dati, i meccanismi precisi attraverso cui il pathway JAK/STAT influenza la nocicezione non sono ancora del tutto chiari. Inoltre, uno studio recente ha evidenziato come l’attivazione della via JAK/STAT stimoli la componente microgliale a livello del midollo spinale, contribuendo al rimodellamento dei circuiti spinali coinvolti nelle caratteristiche neuropatiche e nociplastiche del dolore²⁹.

Razionale e obiettivi dello studio

Sulla base delle premesse discusse in precedenza, si è pensato di esplorare il ruolo della via di segnalazione JAK/STAT nella modulazione del dolore nei pazienti affetti da artrite reumatoide. In particolare, si ritiene che Upadacitinib, farmaco JAK inibitore, possa modulare l’espressione del BDNF in diverse cellule coinvolte nell’asse neuro-immune e nella patogenesi dell’artrite reumatoide, sostenendo così alcuni dei più importanti meccanismi della genesi e del mantenimento del dolore cronico. Questa ipotesi è stata indagata sia mediante un’analisi in vivo ed ex vivo su pazienti affetti da artrite reumatoide, sia mediante la creazione e l’analisi di un modello in vitro di cellule microgliali isolate da soggetti sani.

Il primo obiettivo riguarda l’analisi del potenziale ruolo del BDNF come marcatore del dolore cronico nell’artrite reumatoide. Questo aspetto sarà valutato tramite uno studio clinico open-label, osservazionale, longitudinale, prospettico, monocentrico, volto ad esplorare i livelli sierici del BDNF, correlandoli alla risposta alla terapia con Upadacitinib sia dal punto di vista clinico sia tenendo in considerazione la percezione soggettiva del dolore riportata dai pazienti.

Il secondo obiettivo della tesi è indagare la capacità di Upadacitinib di modulare le vie del dolore e, in particolare, l’espressione del BDNF nelle cellule microgliali. Nonostante ci siano evidenze sempre più importanti, specialmente su modelli animali, dell’attivazione microgliale in corso di artrite reumatoide, in letteratura sono disponibili ancora pochi dati sulla potenzialità di conventional, biologic e targeted synthetic DMARDs di modulare la risposta microgliale nell’uomo; parte della tesi tenterà di colmare questo vuoto.

Materiali e metodi

Per lo studio in vivo ed ex vivo, sono stati reclutati 34 pazienti con artrite reumatoide candidati a terapia con Upadacitinib, arruolati tra aprile 2022 e ottobre 2023 presso il Policlinico Universitario Campus Bio-Medico di Roma. I criteri di inclusione prevedevano un’età superiore ai 18 anni, un’attività di malattia moderata o elevata e una diagnosi conforme ai criteri ACR/EULAR 2010³⁰. Sono stati esclusi pazienti in gravidanza, con neoplasie recenti o infezioni gravi. Dopo aver ottenuto il consenso informato, i pazienti sono stati sottoposti a due visite: una prima dell’inizio della terapia con Upadacitinib (T0) e una dopo 4 mesi di trattamento (T4). Durante ciascuna visita, è stata effettuata una valutazione reumatologica approfondita e un’analisi psicometrica del dolore, includendo aspetti quali la catastrofizzazione e la presenza di sintomi depressivi. Le variabili cliniche analizzate comprendevano il Disease Activity Score (DAS28), il Clinical Disease Activity Index (CDAI), lo Simplified Disease Activity Index (SDAI), il numero di articolazioni dolenti (TJ) e tumefatte (SJ) e il Patient Global Assessment (PGA), oltre ai livelli di VES e PCR per il monitoraggio dell’infiammazione sistemica. È stato inoltre somministrato il questionario HAQ per la valutazione della disabilità funzionale. Per indagare la percezione del dolore e il benessere psicologico, i pazienti hanno completato diversi questionari psicometrici, tra cui la scala VAS per l’intensità del dolore, il Pain Quality Assessment Scale (PQAS) per le caratteristiche qualitative del dolore, il Pain Catastrophizing Scale (PCS) per la valutazione della catastrofizzazione, il McGill Pain Questionnaire (MPQ) per l’analisi delle componenti sensoriali ed emotive del dolore e il Beck Depression Inventory (BDI) per valutare la presenza di sintomi depressivi. I pazienti, al termine di ogni visita reumatologica, sono stati sottoposti a un prelievo di sangue venoso periferico. Il siero è stato isolato mediante centrifugazione a 1800 RPM per 15 minuti, raccolto e conservato a -80 °C fino all’analisi. L'espressione sierica di BDNF è stata valutata mediante tecnica ELISA a sandwich. Il segnale risultante è stato misurato con uno spettrofotometro Tecan, convertendo l'assorbanza ottica in concentrazioni di BDNF (pg/mL) mediante una curva logaritmica 4PL basata su standard a concentrazioni note. L'intero protocollo è stato eseguito seguendo le istruzioni del produttore, con le opportune modifiche per ottimizzare l’analisi.

Per l’analisi in vitro, è stato sviluppato un modello di microglia umana derivata da monociti, noto come monocyte-derived microglia-like (MDMi) cells³¹. I monociti sono stati isolati da sangue venoso periferico di controlli sani mediante separazione densitometrica con Lympholyte®, seguita da adesione differenziale su piastre di coltura. Il loro differenziamento in cellule microgliali è stato ottenuto attraverso l’incubazione per 14 giorni con specifici fattori di crescita e citochine, mentre l’attivazione verso un fenotipo pro-infiammatorio M1 è stata indotta con IFNγ e LPS. Le cellule microgliali così ottenute sono state incubate per 48 ore in sei diverse condizioni sperimentali: un gruppo di colture è stato lasciato non trattato, mentre un altro è stato esposto a IL-6 per simulare un ambiente infiammatorio analogo a quello dell’artrite reumatoide. In parallelo, Upadacitinib è stato somministrato a concentrazioni di 0.1 µmol e 1 µmol, sia da solo che in combinazione con IL-6, generando quattro ulteriori condizioni sperimentali. Questo setup ha permesso di valutare l’effetto di Upadacitinib, singolarmente e in presenza di IL-6, sulla modulazione della risposta infiammatoria microgliale. L’espressione di BDNF nelle diverse condizioni di coltura è stata analizzata mediante citometria a flusso, utilizzando anticorpi fluorescenti specifici dopo fissazione e permeabilizzazione cellulare. I segnali rilevati sono stati acquisiti tramite citofluorimetro ed espressi come intensità media di fluorescenza. Inoltre, l’immunocitofluorescenza ha permesso di confermare l’espressione di BDNF nelle diverse condizioni sperimentali. Le cellule, fissate e permeabilizzate, sono state incubate con anticorpi primari e secondari coniugati a fluorofori, quindi analizzate al microscopio a fluorescenza, con successiva quantificazione dei segnali tramite software ImageJ. Per approfondire il ruolo di Upadacitinib nella regolazione dei pathway associati al dolore nella microglia, è stata inoltre condotta un’analisi di RNA sequencing nelle diverse condizioni di coltura cellulare. L’RNA è stato estratto e inviato a un’azienda specializzata per il sequenziamento Illumina, con successivo filtraggio dei geni differenzialmente espressi e rappresentazione dei dati attraverso heatmaps generate in R.

Le analisi statistiche sono state effettuate con il software STATA. Le variabili continue sono state espresse come mediana e intervallo interquartile, mentre quelle categoriche in percentuale. Il test di Wilcoxon per dati appaiati è stato utilizzato per confrontare le variabili cliniche nei due tempi di valutazione, mentre il test di Mann-Whitney ha permesso di analizzare le differenze tra gruppi nei dati di laboratorio. Una p < 0.05 è stata considerata statisticamente significativa.

Risultati

Al termine dei 4 mesi di follow-up, solamente per 2 pazienti, su un campione di 34, è stato necessario interrompere la terapia con Upadacitinib. Questi, non hanno completato le valutazioni clinico-psicometriche e sono stati esclusi dal campione finale. L’aderenza terapeutica, misurata con il questionario CQR5, è stata pressoché massima (punteggio medio di 19,48 su 20).

Il trattamento con Upadacitinib ha mostrato una netta riduzione di tutti i parametri clinici correlati al dolore, incluso il questionario sulla disabilità HAQ. Le valutazioni psicometriche hanno evidenziato una diminuzione dei punteggi relativi alla catastrofizzazione del dolore (PCS), alla qualità complessiva del dolore (MPQ) e ai sintomi depressivi (BDI). Inoltre, sono stati osservati miglioramenti nelle diverse dimensioni della qualità del dolore valutate tramite PQAS, tra cui il dolore intenso, acuto, caldo e sordo (Fig. 3, 4).

La proteina BDNF, analizzata nel siero dei pazienti, ha mostrato un lieve aumento non significativo dal T0 al T4. Inoltre, non ha mostrato alcuna correlazione con la riduzione del dolore osservata attraverso l’analisi clinica (Fig. 5).

La corretta generazione del modello microgliale è stata confermata osservando le cellule al microscopio ottico, le quali mostravano la tipica morfologia dalla forma ameboide, ricca in granuli citoplasmatici e di diversi prolungamenti e ramificazioni cellulari. Per una conferma più precisa si è verificata l’espressione del marcatore specifico microgliale TMEM-119 mediante lettura con microscopio a fluorescenza.

L’analisi citofluorimetrica ha mostrato una riduzione significativa dei livelli di BDNF nei campioni di cellule microgliali trattate con Upadacitinib; in particolar modo nelle condizioni con Upadacitinib 0,1 µmol con e senza IL-6 e nella condizione con Upadacitinib 1 µmol con IL-6 (Fig. 6A). Per confermare il dato ottenuto mediante analisi citofluorimetrica, è stata condotta anche un’analisi di immunofluorescenza che ha mostrato una riduzione significativa dei livelli di BDNF espressi dalle cellule microgliali trattate con Upadacitinib 0.1 µmol e 1 µmol sia nella condizione con IL-6 che senza IL-6 (Fig. 6B).

L’analisi di RNA sequencing ha mostrato una riduzione dell’espressione dei geni della via JAK/STAT nelle cellule microgliali trattate con Upadacitinib (Fig. 7A). Inoltre, sia nel cluster genico riguardante il dolore acuto e cronico (Fig. 7B, 7C), che nel cluster di geni legati alla neuroinfiammazione si evidenzia una differenza di espressione genica tra le colture cellulari trattate con Upadacitinib e le colture non trattate.

 

Fig. 3. Variazione dei parametri clinici pre e post trattamento.

 

Fig. 4. Variazione dei parametri clinico-psicometrici correlati al dolore pre e post trattamento.

 

Fig. 5. Variazioni del BDNF sierico pre e post trattamento.

 

Fig. 6. Espressione del BDNF nelle diverse condizioni di coltura microgliale 6A. Espressione del BDNF analizzata mediante citofluorimetria 6B. Espressione del BDNF mediante analisi in immunofluorescenza.

 

Fig. 7. Differenze nell'espressione genica tra le condizioni di coltura microgliale: 7A geni del pathway JAK/STAT, 7B geni correlati al dolore acuto 7C geni correlati al dolore cronico.

 

Discussione

Lo studio ha analizzato l’effetto di Upadacitinib sulla modulazione del dolore, sia attraverso un modello in vitro di cellule microgliali che mediante un’analisi clinica su 34 pazienti con artrite reumatoide. I dati di laboratorio hanno evidenziato che il farmaco riduce l’espressione del BDNF nelle cellule microgliali e modula l’attività di geni coinvolti nei meccanismi del dolore e della neuroinfiammazione. Poiché il BDNF è considerato un mediatore chiave della sensibilizzazione centrale, la sua riduzione nelle cellule trattate con Upadacitinib potrebbe spiegare l’efficacia del farmaco nel controllo del dolore residuo non infiammatorio. Inoltre, l’analisi di RNA sequencing ha confermato il coinvolgimento di altri pathway regolati dalla microglia, rafforzando l’ipotesi di un ruolo diretto di Upadacitinib nella modulazione del dolore.

L’analisi clinica ha dimostrato una significativa riduzione del dolore dopo quattro mesi di trattamento, insieme a un miglioramento dei parametri psicometrici, inclusi la catastrofizzazione del dolore e i sintomi depressivi. Tuttavia, i livelli sierici di BDNF non hanno mostrato variazioni significative né una correlazione con il miglioramento clinico. Questi risultati sono preliminari, poiché l’analisi sierica è stata condotta solo su 23 dei 34 pazienti arruolati, e un follow-up più lungo potrebbe rivelare eventuali variazioni tardive. I dati clinici sono in linea con la letteratura esistente, che evidenzia un maggiore controllo del dolore residuo con i JAK inibitori rispetto agli anti-TNFα.

La letteratura scientifica ha già dimostrato che i livelli sierici di BDNF sono aumentati nei pazienti con artrite reumatoide rispetto ai controlli sani e che la proteina gioca un ruolo chiave nella sensibilizzazione centrale. Tuttavia, le evidenze riguardanti l’interazione tra b/tsDMARDs e la microglia sono ancora scarse. Inoltre, la maggior parte degli studi in vitro si basa su linee cellulari microgliali murine (BV2), mentre l'impiego di un modello di microglia umana potrebbe offrire dati più accurati e maggiormente trasferibili alla fisiopatologia umana.

Tra i limiti dello studio, la dimensione del campione potrebbe aver ridotto la potenza statistica, in particolare per l’analisi sierica di BDNF. Inoltre, il follow-up di quattro mesi potrebbe non essere sufficiente per osservare cambiamenti significativi. Un possibile sviluppo futuro potrebbe prevedere la creazione di un modello di microglia derivata da monociti di pazienti con artrite reumatoide, per confrontare la loro espressione basale di BDNF e la risposta a Upadacitinib rispetto ai controlli sani. Ciò permetterebbe di ottenere una comprensione più approfondita del ruolo della microglia nella sensibilizzazione centrale e nel dolore cronico, contribuendo allo sviluppo di trattamenti più mirati ed efficaci.

Conclusione

In conclusione, i risultati dello studio mostrano che Upadacitinib riduce l'espressione del BDNF nelle cellule microgliali e modula diverse vie coinvolte nella neuroinfiammazione e nella percezione del dolore. L’analisi di laboratorio ha evidenziato un effetto diretto di Upadacitinib sulla regolazione dei meccanismi infiammatori microgliali, suggerendo un possibile ruolo nella modulazione della sensibilizzazione centrale e periferica e nella riduzione del tasso di dolore nociplastico osservato nella pratica clinica. Tuttavia, nonostante queste evidenze a livello cellulare, i livelli sierici di BDNF nei pazienti trattati con Upadacitinib non hanno mostrato variazioni significative. Questo dato indica che, sebbene Upadacitinib influenzi la risposta infiammatoria microgliale in vitro, il BDNF sierico non rappresenta un biomarcatore affidabile per valutare la modulazione del dolore in vivo. Studi futuri su modelli preclinici e analisi molecolari più approfondite saranno necessari per chiarire i meccanismi d'azione di Upadacitinib e il suo impatto sulla neuroinfiammazione.